重组DNA与分子克隆
多克隆位点(multiple cloning site)
/ MCS /
想象一条工具腰带,每件工具都有一个槽位,全都整齐地排列在一处。多克隆位点就是载体上一小段DNA,里面密集排着一连串不同的限制位点,全都集中在一个整洁的区域——一条专门设计的“着陆跑道”,你可以在这里切开载体、插入你的基因。
多克隆位点(MCS,也叫多接头)是一段合成的序列,长约50到100个碱基对,经过设计使其聚集着许多独特的限制位点——如EcoRI、BamHI、HindIII等,每个在整个载体中都只出现一次。“独特”是关键:因为每种酶在MCS中只切它那一个位点,你就能在恰好选定的一处干净地切开载体,而不在别处把它切碎。更妙的是,你可以用两种不同的酶切割,造出两个不同的黏性末端,再连接进一段用同样两种酶处理过的插入片段,使它只能以一种朝向进入——这就是定向克隆。
MCS是克隆载体在实践中的核心。它给你一份灵活的切点菜单,让你能针对特定的插入片段选用任何方便的酶。在许多载体中,MCS被巧妙地安放在一个报告基因片段(lacZ基因)内部,于是成功在此插入DNA会破坏该报告基因——这正是蓝白筛选区分重组菌落和空载菌落的依据。
要做定向克隆,用EcoRI切载体MCS的一端、用BamHI切另一端,得到两个不同的突出端。把你的插入片段也制备成EcoRI端和BamHI端。这样插入片段只能以一种方式连接——它的EcoRI端对上载体的EcoRI端——于是基因每次都以正确的方向进入。
MCS中用两种不同的酶,迫使插入片段以一种朝向进入。
MCS中的限制位点只有在它对载体是独特的、且不会同时切在你的插入片段内部时才有用——务必检查你选的酶在你想保持完整的基因内部没有位点。
又称
另见