重组DNA与分子克隆

凝胶电泳(gel electrophoresis)

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想象一群体型各异的赛跑者挤过一片密林冲向终点。小巧灵活的很快钻过去;高大笨重的被勾住、落在后面。让他们都跑同样的时间,就会按体型散开。凝胶电泳对分子做的正是这件事,用电力来推、用果冻般的凝胶当密林。

DNA和RNA沿骨架带有均匀的负电荷,所以在电场中它们都朝正极移动。你把样品加进凝胶板一端的孔里——DNA用琼脂糖,小片段或蛋白用更细密的聚丙烯酰胺——然后接通电流。凝胶是一张微观的网,短片段很快穿网、走得远,长片段被拦住、留在起点附近。跑完之后,每个长度相同的片段都迁移了相同的距离,形成一条清晰的条带。给DNA染色(用一种在紫外光下发光的染料)便显出一道条带阶梯,与已知的大小标准比对,就能得知每个片段的长度。蛋白没有均匀的电荷,要先用去垢剂SDS包裹,使其带上均匀的负电荷,于是它们也纯按大小分离(SDS-PAGE)。

凝胶电泳是分子生物学实验室里日常的主力——它是你真正“看见”DNA的方式:检验限制酶酶切是否如计划那样切开、确认PCR是否成功、把某条带从凝胶里切下来纯化片段,或估测一个基因或蛋白的大小。它也是各种印迹方法底下的分离步骤:Southern、Northern和Western印迹都从把分子在凝胶上跑开开始。

你用一种酶酶切质粒,并在琼脂糖凝胶上把它与一组已知大小的“梯子”并排跑。一条单一条带出现在与3000碱基对刻度齐平处——确认该质粒正是预期的3千碱基,且被干净地线性化了。更小的片段会朝正极更往下跑。

更小的片段走得更远;条带位置揭示大小。

标准凝胶按大小分选线性DNA,但环状和超螺旋的质粒相对其长度跑得异常地快——所以一个未切开的质粒,其条带位置并不能可靠地读出大小。

又称
agarose gelSDS-PAGE凝胶电泳电泳