苗头识别与筛选

生化检测法

生化检测法是把化合物针对靶点蛋白本身来测试——把蛋白纯化出来、置于试管中,剥离了细胞及其一切复杂性。这就像把锁从门上卸下、放到工作台上来试钥匙:你能确切看到钥匙如何契合这把锁,而不被周围的房子干扰。

通常把纯化的靶点(一种酶、受体或其他蛋白)与其底物或配体以及被测化合物置于规定的缓冲液中,由一个干净的读出报告结果——对酶而言是产物生成的速率,对结合相互作用而言是标记配体被置换的程度。由于体系只含已知成分,数据界定清晰、易于定量解读,且非常适合测量IC50和抑制常数等精确的效力值。

这种干净的代价是失去情境。生化检测法对化合物能否穿过细胞膜、能否抵御代谢,或能否在活体系统内击中靶点都一无所知,而纯化的蛋白可能采取某种构象,或缺少细胞中存在的伙伴分子。这正是生化检测法通常要与细胞检测法配对的原因——后者以牺牲清晰度为代价恢复了生物学情境。

把纯化的蛋白酶与荧光底物混合;被测化合物的IC50直接由它使荧光增长减慢的程度读出。

仅含纯化成分,生化检测法给出干净、定量的效力。

生化检测法中的效力常与细胞中的效力不同:一个化合物在试管里可能是强效酶抑制剂,却因进不了细胞而在细胞中很弱,反之亦然。两种读出是互补的,不能互相替代。

又称
in vitro biochemical assay体外生化检测法體外生化檢測法