限制酶（restriction endonuclease）
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想像你想把一句很長的話切成幾段，但只在某個確切短語出現的地方切——其他任何地方都不動。限制酶就是一把對DNA做這件事的蛋白質剪刀：它沿著雙螺旋掃描，找到一段短而特定的序列，只在那裡切開。這類酶是細菌發明的，卻成了分子生物學家最重要的一把切割工具。
內切酶是指在鏈的中間切割核酸的酶（endo＝內部），有別於從末端逐個啃咬。限制酶是其中的特殊一類：它識別一段短的DNA序列——通常為4到8個鹼基對，常常是回文——並在該位點處或附近把兩條鏈的糖磷酸骨架切斷。例如著名的EcoRI找到序列 5'-GAATTC-3'（與 3'-CTTAAG-5' 配對），在每條鏈的G與第一個A之間切開。每種酶都有自己固定的識別序列，所以同一種酶總是在同一DNA的同樣位置切割，得到可重複的片段。
因為切割是序列特異且可重複的，這些酶讓你能把任意DNA切成確定的片段並重新組合——它們正是分子選殖中的「切」這一步。市售的酶有數百種，每種以其來源細菌命名（EcoRI來自大腸桿菌Escherichia coli，HindIII來自流感嗜血桿菌Haemophilus influenzae）。1978年諾貝爾獎授予了發現它們的阿爾伯、內森斯和史密斯。沒有限制酶，重組DNA技術——乃至現代生物學的大部分——都將不復存在。
EcoRI遇到序列 5'-GAATTC-3' / 3'-CTTAAG-5'。它在每條鏈的G與A之間切開，產生兩段，每段都以單鏈的 5'-AATT 突出末端結尾。把同一種酶加到兩個不同的DNA上，二者都會獲得相同的AATT突出端——可以彼此連接。
EcoRI切割GAATTC，在兩個片段上都留下匹配的黏性末端。
限制酶只在其確切識別序列出現處切割——它分辨不出你關心的是哪個基因，所以同一種酶會在該位點恰好出現的任何地方切開你的插入片段和載體。