擴增、定序與核酸分析
變性-退火-延伸循環(denaturation-annealing-extension cycling)
PCR是怎樣把一份拷貝變成十億份的?不是靠一步登天,而是靠把一段短短的三溫度之舞反覆跳上許多遍。每跳一遍,目標大致翻倍,而一台叫熱循環儀的機器只是按定時器改變管子的溫度來驅動它。這支舞就是:變性,然後退火,然後延伸。
變性:加熱到約95攝氏度。維繫雙螺旋的氫鍵斷裂,兩條鏈分開,得到單鏈模板。退火:冷卻到大約50到65攝氏度。在這個較低的溫度下,短引物找到模板上各自匹配的序列並與之鹼基配對。延伸:升溫到約72攝氏度,這是Taq聚合酶最喜歡的溫度。Taq從每條引物的3'端起步,合成一條新的互補鏈,複製模板。然後循環重複。關鍵在於:一個循環裡新合成的鏈會成為下一個循環的模板,於是目標分子數呈幾何級數增長:1、2、4、8、16……即指數增長。
這個溫度循環就是PCR的引擎,而調好它很重要。退火溫度太低,引物會鬆散地貼到近似匹配處,產生非特異產物;太高則根本不結合。實際上指數增長不會永遠持續——隨著試劑耗盡、產物堆積,反應會進入平台期,這也是為什麼單純數最終產物的量來推測起始量是個很差的辦法(這正是定量PCR被發明出來要解決的問題)。
一個典型程序:95C 30秒(變性),58C 30秒(退火),72C 60秒(延伸),重複35次。從單個分子起步,理論上35次翻倍可得超過300億份拷貝——儘管反應會在達到這個理想值之前進入平台期。
三個溫度、重複30到40次,驅動指數級複製。
翻倍只是「大致」兩倍,而且只在試劑充足時如此;一旦引物、核苷酸或酶活性不足,增長就放緩並停止,所以最終的量並不與你的起始量成正比。
又稱
另見