重组DNA与分子克隆
表位/亲和标签(epitope / affinity tag)
/ EP-ih-tope /
想象给一件物品缝上一个独特的小把手,这样你就能在人群中随时抓住它或认出它。在蛋白工作中,生物学家正是这么做:他们用基因手段在蛋白上加一段短的、标准化的序列,从而有一种可靠的办法去检测它,或把它从混乱的混合物里拽出来。这个附加物叫标签,而蛋白加标签就构成融合蛋白。
标签有两种相互交叠的类型,都是通过把编码标签的额外DNA融合到你的基因上来附加,使蛋白在合成时就自带标签。表位标签是一段短肽,一种众所周知的抗体会紧紧结合它(例如FLAG、HA、Myc)。由于有现成的抗体识别它,你就能检测、定位或纯化任何戴着该标签的蛋白——当蛋白本身没有好抗体时尤其方便。亲和标签则是一种能结合特定基质的标签,让你只需把细胞提取液流过该基质即可纯化蛋白;标签黏住,其余一切被洗掉,再把纯蛋白洗脱下来。经典例子是His标签(六个组氨酸),它结合镍柱。一个标签常常同时担任两种角色。
标签是蛋白纯化和检测的日常工具。它让你能一步就从成千上万种蛋白里钓出某一种,用一种标准抗体在Western印迹上检测它,或捕获它的结合伙伴(pull-down实验)。代价与任何融合相同:标签是外来的额外质量,偶尔会干扰折叠、活性或定位,所以标签常被放在末端,有时事后还会用一种在内置位点切割的蛋白酶把它去掉。
给你的蛋白加上His标签,并在大肠杆菌中表达。裂解细胞,把这锅“汤”倒过镍柱。你那带His标签的蛋白紧附在镍上,其余一切流走;一次冲洗把它清理干净,再用一种缓冲液一步就把纯蛋白释放出来。
His标签让一种蛋白紧附镍柱,实现一步纯化。
标签是外来的额外序列,可能微妙地改变折叠、活性或定位——所以好的做法是核实带标签的蛋白仍表现得像天然蛋白,并在必要时去掉标签。
又称
另见