重組DNA與分子選殖
定點誘變(site-directed mutagenesis)
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如果你想弄清一句話裡某個詞起什麼作用,最乾淨的實驗就是只改那一個詞、再讀讀會發生什麼——其餘一概不動。定點誘變就是為基因設計的這種實驗:它讓你在一段已選殖的DNA序列的精確位置上做出一處選定的、刻意的改動,然後追問這處改動如何影響蛋白。
經典的方法用一段合成引物——一小段與你的靶區相匹配、卻帶有你想要的確切鹼基改動的DNA。你把這段幾乎匹配的引物退火到你選殖的基因上;那一個錯配的鹼基鼓出來,但引物仍能結合。隨後一種DNA聚合酶延伸該引物,複製整個質粒,把你設計的改動併入新鏈。去掉原來的(未突變的)模板後,你就得到帶有你所指定的那個突變的質粒——一處替換的鹼基、一處缺失或一處插入,恰恰在你放置的位置。現代試劑盒讓這件事成了常規操作。
定點誘變把蛋白變成了可編輯的文本。它是你檢驗關於某蛋白的假說的辦法:把一種酶活性中心裡的某一個特定氨基酸改掉,看催化是否隨之失效,從而確認那個殘基的作用;或修復一個致病突變;或改造出性能更優的蛋白。哈欽森和邁克爾·史密斯開創了它,史密斯因此分享了1993年諾貝爾獎。注意它的適用範圍:它編輯的是你已經在試管裡選殖的DNA——這是蛋白工程的工具,與CRISPR基因組編輯不同,後者改變的是活細胞裡基因原位的序列。
要檢驗某個特定的絲氨酸對一種酶是否必不可少,你設計一段引物,把它的密碼子改成編碼丙氨酸的,對選殖的基因做誘變,表達突變體蛋白並測定其活性。如果這酶現在失活了,那這個絲氨酸對催化確實至關重要——一個改動單個殘基、答案明確的實驗。
改動一個密碼子,表達蛋白,再讀出後果。
定點誘變編輯的是試管裡選殖的DNA,而不是染色體上原位的基因——細胞內的那種編輯是CRISPR及相關基因組編輯工具的事,屬於另一個領域。
又稱
另見