重組DNA與分子選殖
西方墨點法(Western blot)
/ WES-tern blot /
南方和北方墨點法檢測特定的DNA和RNA。但基因最終是以蛋白的形式發揮作用的,而你常常想知道某種特定蛋白是否存在於樣品中、又有多少。西方墨點法回答的正是這個——它是印漬家族中的蛋白成員,把DNA探針換成了抗體。
首先,細胞提取液中的蛋白在凝膠上按大小分離(SDS-PAGE用去垢劑包裹它們,使其純按大小遷移)。然後把它們轉移到膜上,保留原有的圖案。接著是蛋白特有的轉折:你不用互補的核酸探針,而用抗體——一種免疫蛋白,以極高的選擇性結合一種特定的靶蛋白(靠形狀而非鹼基配對來進行分子辨識)。一抗黏附到你感興趣的蛋白上;隨後一種攜帶酶或螢光標記的二抗結合一抗,放大信號。抗體結合到哪裡,那裡就出現一條帶。條帶的位置確認蛋白的大小,其強度反映存在多少蛋白。
西方墨點法是整個生物學和醫學中最常用的技術之一。它確認你選殖的基因是否真的被翻譯成了蛋白,檢驗某種蛋白在處理下變多還是變少,並檢測像磷酸化這樣的翻譯後變化(用專門辨識修飾形式的抗體)。它也是人們熟悉的一種診斷確認試驗——歷史上曾用於確認HIV抗體。它的局限在於特異性:結果的可信度不會超過抗體本身,而抗體可能結合到非靶蛋白上,給出誤導性的條帶。
你想確認細菌正在製造你選殖的人類蛋白。裂解細胞,把蛋白在SDS-PAGE上跑開,印漬,再用一種抗你那蛋白的抗體探測。在預期分子量處出現一條帶、且僅在被誘導的細胞中出現,就確認該蛋白正在被表達。
找到目標蛋白條帶的是抗體,而不是DNA探針。
西方墨點法的可靠程度不會超過它的抗體——特異性差的抗體會結合到無關蛋白上、產生假條帶,所以乾淨的結果取決於一種經過充分驗證的抗體。
又稱
另見