看见无形之物：按大小分选的凝胶
到现在，你已经能对 DNA 做出惊人的操作——在选定序列处剪开它、把来自不同来源的片段拼接成一条重组分子、把它放进载体，再让细菌去复制。可是一管 DNA 不过是清澈无色的一滴液体。你看不出剪切是否成功、对的插入片段是否进去了、任何东西又有多大。每位分子生物学家最先需要的，就是一种*看见*无形之物的办法——而担此重任的朴素主力，就是凝胶电泳。
这个把戏靠的是你早在核酸那一级见过的一个幸运事实：糖-磷酸骨架沿其全长都带着稳定的负电荷，与序列无关。于是在电场里，*每一段* DNA 都朝同一个方向漂移——奔向正极。倒出一板果冻般的凝胶（琼脂糖，一种海藻提取物），在一端打出一排小孔，把样品加进去，接通电流。凝胶是一张致密的微观网眼，宛如一片灌木丛。短片段灵巧，迅速穿行、跑得很远；长片段被绊住，落在起点附近。跑足设定的时间，分子便按大小铺展开来。
用一种能嵌进堆叠碱基之间、在紫外光下发光的染料给凝胶染色，结果就是一道由清晰明亮的条带组成的阶梯——每一条带都是一堆长度完全相同的片段。在旁边跑一道已知的大小标准品，你就能直接从图上读出每个片段的长度。仅凭这一件工具，你就能确认限制性酶切是否切在你预期的地方、核查一次 PCR 是否做出了正确的产物，或者把想要的条带从凝胶上切下来加以纯化。RNA 跑法相同。蛋白质没有均一的电荷，所以你先用去污剂 SDS 给它们裹上一层、赋予它们一致的负电荷——这样它们也就纯粹按大小分开了（这一版本称作 SDS-PAGE）。
印迹三兄弟：在人群中点名一个分子
印迹把匿名的模糊条带变成一个带标记的明确答案，靠的是你早已烂熟于心的一条原理：互补的链会粘到一起。回想杂交——把两条序列相配的链冷却下来，它们便重新拉链合拢，A 伸过去配 T、G 配 C，在一片其他分子之中找到自己的搭档。同样的咬合也发生在一条 DNA 链与一条互补 RNA 之间。所以，只要你做出一条短的、带标记的单链，其序列正是你目标的互补——一支探针——它就只会在你那段序列所在之处配对，点亮那一条带，绝不点亮别的。
- 分离：把你的分子在凝胶上跑开，让它们按大小铺成一道道条带。
- 转印：把条带从软凝胶里转移到一张结实的膜上，原封不动地保留它们的位置——缓冲液借毛细作用从凝胶里向上渗，把分子带到膜上，就像墨水渗进吸墨纸。
- 探测：把膜浸在带标记的探针里；它只与相配的那条带杂交。
- 检测：读出标记——靠放射性、颜色或发光——你那唯一的序列便以一条清晰条带出现在已知的大小处。
埃德温·萨瑟恩（Edwin Southern）1975 年为 DNA 发明了它——Southern 印迹，史上第一种能在整个复杂基因组里认出某一特定序列的办法，几十年来用于确认一个基因是否存在、数它的拷贝数，或抓出某次重排。把同一套配方用到 RNA 上，你就得到 Northern 印迹：它衡量*一个细胞此刻是否正在使用某基因、用了多少*，因为条带的亮度反映出信使 RNA 有多少，而它的位置揭示出转录本的大小——这对于发现可变剪接很方便，因为同一个基因会产出不同长度的 RNA——这也提醒我们「一个基因，一种蛋白」的说法已经过时。第三个兄弟，Western 印迹，检测的是*蛋白质*，这里探针必须换掉，因为蛋白质不会碱基配对。你用的不是互补链，而是一种抗体——一种凭三维形状认出其目标的免疫蛋白，正是你在蛋白质那一级见过的分子识别。一抗粘住你的蛋白，带标记的二抗放大信号，于是抗体结合之处便出现一条带。要诚实面对它的弱点：一次 Western 的可信度只与它的抗体一样高，而抗体可能粘错蛋白、画出一条误导性的条带。（「Northern」和「Western」这两个名字都是对 Southern 的双关玩笑，并非指南针方向。）
Southern -> DNA probe = labelled complementary DNA Northern -> RNA probe = labelled complementary nucleic acid Western -> protein probe = antibody (recognizes shape) all three: separate on gel -> blot to membrane -> probe -> detect
看着基因发光：报告基因、融合与标签
印迹告诉你的是一张快照——一份你磨碎、在凝胶上跑过的样品。但真正的问题往往是*在何时、何处*某基因在一个*活*细胞或胚胎里被打开、并能实时观看。麻烦在于多数基因是隐形的：它们的产物什么也看不见。聪明的对策，是接上一个容易看见的「打小报告」基因，让你*能够*检测它的活动——一个报告基因。
思路是：把报告基因接到你所研究基因的控制序列——启动子——上。这样每当那个启动子开火，报告基因也随之被制造，它的发光或显色便替你「报告」了活动。有三个报告基因很出名。GFP（绿色荧光蛋白），借自一种水母，在蓝光下发出绿色，于是你真的能在活细胞里看着一个基因被打开，无需磨碎。lacZ 产出一种把无色底物变蓝的酶——正是你在本级早些时候用来挑出成功克隆的那种蓝白筛选背后的颜色变化。而荧光素酶（luciferase），萤火虫的那种酶，会发出光，给出极其灵敏的定量读数。GFP 是一种如此具有变革性的试剂，以致其发现与发展赢得了 2008 年诺贝尔化学奖。
还有第二种、更微妙的用法。你不只是报告某启动子的活动，还可以把标记直接*融合*到一个你关心的蛋白上——把两段编码序列同框拼接，让细胞造出一条同时携带两部分的融合蛋白。把 GFP 融到一个蛋白上，你就能实时跟踪那个确切的蛋白在活细胞里四处移动，边走边发光。这其中的权衡很诚实、也值得记住：标记是外来的额外质量，偶尔会扰乱宿主蛋白的折叠、活性或定位——这正是为什么融合通常放在蛋白的某一端，而非埋在中段。
把同样的融合思路缩小，就得到标签——一个缝在蛋白上的简短标准把手，让你总能在人群中抓住它或认出它。*表位标签*（FLAG、HA、Myc）是一小段肽，现成的抗体会紧紧结合它，于是即便对蛋白本身没有好抗体，你也能检测或定位任何带标签的蛋白——非常适合用一种标准抗体在 Western 印迹上认出它。*亲和标签*则结合某种特定的基质：经典的 His 标签（六个组氨酸，同框加上 5'...catcatcat...3'）会粘在镍柱上，于是你把杂乱的细胞提取液淌过柱子，其余一切被冲走，你一步就洗脱出一种纯净的蛋白。标签能从成千上万种蛋白里钓出单独一种——这是蛋白质纯化的日常通货。
改动一个词：定点诱变
现在从观看转向工程改造。如果你想弄清一句话里某一个词起什么作用，最干净的实验就是*只改那一个词*、看看会发生什么，其余一律不动。定点诱变就是把这个实验用到基因上——在一段已克隆的序列里选定一个精确位点，做出一处刻意的改动，再追问它如何重塑那个蛋白。
这个经典把戏再一次重用了碱基配对。你合成一条短引物，它与你的目标区域配得*几乎*完美——只是带上了你想要的那个确切的碱基改动。把它退火到你的克隆基因上：那个唯一错配的碱基鼓了出来，但引物其余部分抓得够牢、足以保持结合。随后一种 DNA 聚合酶从引物延伸、复制整个质粒，忠实地把你设计的改动建进新链。除掉原来的未突变模板，你手里剩下的质粒便*恰好*带着你指定的那个突变——一个被替换的碱基、一处缺失，或一处插入，分毫不差地落在你放置之处。现代试剂盒让这一切成了常规操作。
这能给你带来什么？定点诱变把蛋白质变成了可编辑的文本。怀疑某个酶活性位点里的某一个氨基酸负责催化（这是酶那一篇里的想法）？只改那一个残基，看着活性消失——这一处干净的替换便确证了该残基的作用，而那些更笨重的实验做不到这一点。同一件工具还让你修复克隆基因里的某个致病突变，或刻意改造出性质更优的蛋白。查尔斯·哈钦森（Charles Hutchison）和迈克尔·史密斯（Michael Smith）开创了它，史密斯因为给了生物学一种逐字改写基因的办法而分享了 1993 年诺贝尔奖。
回报所在：造出真实的蛋白，比如胰岛素
至此为止的一切——让你看见的凝胶、为之点名的印迹、让你观看和抓取的报告基因与标签、让你编辑的诱变——都服务于整级阶梯的那个大回报：有意地、成批地造出一种有用的蛋白。这一步就是重组蛋白表达。克隆一个基因只是把指令搁上了架子；表达则是让一个宿主细胞真正*读出*它、并把产物造出来，往往是一桶一桶地造。
你把它建在一个*表达载体*上——一种与普通克隆载体不同的质粒，它携带着宿主真正造蛋白所需的信号：一个强启动子来驱动大量转录、一个核糖体结合信号，通常还有一个开关，让你在选定的时刻打开表达。你把基因插进去——通常是不含内含子的 cDNA，由逆转录酶读取 mRNA 制成，于是一个不会剪接的细菌也能拿到一段干净、可直接读取的编码序列——转化宿主、培养一大缸，然后拨动开关（比如加入诱导剂 IPTG），命令细胞按它们处理自身基因时所用的同一条 DNA -> RNA -> 蛋白 流程，把你的蛋白大量倾倒出来。
正是这一步兑现了重组 DNA 的实际承诺。在它之前，供医药用的人类蛋白只能从动物组织里一点一点地刮取。重组胰岛素（Humulin，1982 年）是第一种重组药物：人胰岛素基因在细菌中表达，给出无限量、稳定一致的*人源*供应，取代了猪和牛的胰岛素。有一条诚实的注意事项决定你选哪个宿主：大肠杆菌是便宜又快的主力，但它无法完成许多真核的收尾修饰——加上糖链（糖基化）或形成某些折叠——所以需要这些修饰的人类治疗性蛋白，会改在酵母或哺乳动物细胞里制造，挑选它们正是为了让蛋白正确折叠并被正确修饰。
退后一步看，这套工具箱连成了一道完整的弧线。你把一个基因剪切粘贴进载体；你在凝胶上看见了那些片段；你用印迹给某个特定分子点了名；你用报告基因看着一个基因开火、用标签抓住了它的蛋白；你用诱变对那个蛋白做了微调；最后你命令一个细胞把它制造出来。这正是分子生物学不再只是描述生命、而开始用生命*建造*的时刻——这门工程科学，将在接下来带着 PCR 与测序的几级阶梯里，被磨砺成一门精确而惊人的技艺。