同时看两个基因：自由组合与 9:3:3:1

从一个基因到两个基因

双基因杂交同时追踪两个基因。孟德尔用了种子形状（圆 R 对皱 r 显性）和种子颜色（黄 Y 对绿 y 显性）。他把纯种圆黄植株（RRYY）与纯种皱绿植株（rryy）杂交。和之前一样，每株 F1 从父母双方各得每个基因的一个等位基因，所以全部 F1 都是 RrYy——又圆又黄，因为两个显性都显现。

有意思的问题是：当这些 RrYy 植株自花授粉时会发生什么？圆会不会始终跟着黄一起遗传，就像它们在最初亲本中那样配对？还是这些基因会自由洗牌？答案就是孟德尔第二定律。

自由组合定律

自由组合定律说的是：不同基因的等位基因，会彼此独立地分配进配子。一个配子拿到 R 还是 r，与它拿到 Y 还是 y 毫无关系。因此一株 RrYy 植物会产生四种数量相等的配子：RY、Ry、rY 和 ry——各占四分之一。

4×4 方格与 9:3:3:1

由于每个亲本有四种配子，庞纳特方格变成了带十六个格子的 4×4 网格。把这十六个按表型归类，就得到F2 世代经典的表型比例。

Cross: RrYy x RrYy
Gametes from each parent: RY, Ry, rY, ry

        RY      Ry      rY      ry
      +-------+-------+-------+-------+
  RY  | RRYY  | RRYy  | RrYY  | RrYy  |
      +-------+-------+-------+-------+
  Ry  | RRYy  | RRyy  | RrYy  | Rryy  |
      +-------+-------+-------+-------+
  rY  | RrYY  | RrYy  | rrYY  | rrYy  |
      +-------+-------+-------+-------+
  ry  | RrYy  | Rryy  | rrYy  | rryy  |
      +-------+-------+-------+-------+

Count by phenotype (R_ = round, Y_ = yellow):
   9  round  yellow   (R_Y_)
   3  round  green    (R_yy)
   3  wrinkled yellow (rrY_)
   1  wrinkled green  (rryy)
                    ->  9 : 3 : 3 : 1

双基因 F2 方格：十六个等可能的格子，归并为 9:3:3:1 的表型比例。

注意中间那两类——圆绿与皱黄。这些是任一最初亲本都不曾有的新组合。它们正是自由组合的可见证据：若圆始终与黄锁在一起，这些重组类型就绝不可能出现。孟德尔真实的 F2 计数（315 : 101 : 108 : 32）接近 9:3:3:1，而新性状组合的出现，恰恰是这次杂交如此重要的原因。