JOVANA
Library Glossary Getting Started Three Levels Fields How it works Mission
Join the mission
All guides

PCR与凝胶电泳

两个日常主力工具:PCR在试管中把选定的一段DNA复制数百万次,而凝胶电泳按大小分离DNA片段,让你看清自己手上有什么。

PCR:DNA的复印机

在细菌中克隆很强大,但速度慢。聚合酶链式反应(PCR)试管中复制一段特定的DNA,完全不需要细胞,几个小时就能完成。它借用细胞自身的复制酶——DNA聚合酶,并一遍又一遍地重复同样的三步循环。

是什么让PCR只复制你想要的那一段?是叫做引物的短小定制DNA片段。你设计两条引物,使它们与目标两侧的序列碱基配对——每条链上各一条。聚合酶只从引物开始复制,因此它精确地填补两条引物之间的区域,而不复制别的部分。

  1. 变性:加热到约95 °C,使双螺旋解开为两条单链。
  2. 退火:冷却到约55 °C,使引物与其匹配位点碱基配对。
  3. 延伸:升温到约72 °C,使DNA聚合酶从引物开始合成新链。
  4. 重复循环25–35次;每一轮目标加倍,因此拷贝呈指数增长。

凝胶电泳:按大小分离

一旦你有了DNA片段,就需要看到它们并核对其大小。凝胶电泳能做到这一点。你把DNA加进一块果冻状凝胶一端的样品孔里,并施加电场。DNA带负电,因此向正极迁移——但它必须从凝胶的网孔中穿行而过。

较小的片段轻松穿过网孔,跑得远;较大的片段被拖慢,停留在样品孔附近。过一会儿,混合物就铺展成一条条独立的条带,按大小排列。把你的条带与已知大小的“梯”相比较,就能知道每个片段有多大——这是快速核对PCR或限制酶切割是否给出了你预期片段的方法。

Gel after the run (DNA moves DOWN, toward + electrode):

   wells:  [Ladder] [Sample]      <- start, near - electrode
           =====    =====
   large   --3000--                slow, stays high
           --2000-- ----2000----   sample band lines up at 2000
   small   --1000--                fast, travels far
                    ---- (none) ----
           v v v v  v v v v
                                    <- finish, near + electrode

Reading: the sample's single band sits level with the 1000-bp
rung of the ladder, so the PCR product is about 1000 base pairs.
较小的DNA跑得更远;把条带与梯对齐即可读出其碱基对大小。