PCR:DNA的复印机
在细菌中克隆很强大,但速度慢。聚合酶链式反应(PCR)在试管中复制一段特定的DNA,完全不需要细胞,几个小时就能完成。它借用细胞自身的复制酶——DNA聚合酶,并一遍又一遍地重复同样的三步循环。
是什么让PCR只复制你想要的那一段?是叫做引物的短小定制DNA片段。你设计两条引物,使它们与目标两侧的序列碱基配对——每条链上各一条。聚合酶只从引物开始复制,因此它精确地填补两条引物之间的区域,而不复制别的部分。
- 变性:加热到约95 °C,使双螺旋解开为两条单链。
- 退火:冷却到约55 °C,使引物与其匹配位点碱基配对。
- 延伸:升温到约72 °C,使DNA聚合酶从引物开始合成新链。
- 重复循环25–35次;每一轮目标加倍,因此拷贝呈指数增长。
凝胶电泳:按大小分离
一旦你有了DNA片段,就需要看到它们并核对其大小。凝胶电泳能做到这一点。你把DNA加进一块果冻状凝胶一端的样品孔里,并施加电场。DNA带负电,因此向正极迁移——但它必须从凝胶的网孔中穿行而过。
较小的片段轻松穿过网孔,跑得远;较大的片段被拖慢,停留在样品孔附近。过一会儿,混合物就铺展成一条条独立的条带,按大小排列。把你的条带与已知大小的“梯”相比较,就能知道每个片段有多大——这是快速核对PCR或限制酶切割是否给出了你预期片段的方法。
Gel after the run (DNA moves DOWN, toward + electrode):
wells: [Ladder] [Sample] <- start, near - electrode
===== =====
large --3000-- slow, stays high
--2000-- ----2000---- sample band lines up at 2000
small --1000-- fast, travels far
---- (none) ----
v v v v v v v v
<- finish, near + electrode
Reading: the sample's single band sits level with the 1000-bp
rung of the ladder, so the PCR product is about 1000 base pairs.