分子剪刀与胶水

会读序列的剪刀

要把一个基因粘到某处，你首先得把它干净地剪下来。限制性内切酶是一种蛋白质，最初借自细菌，它扫描DNA，并只在找到特定短序列处才切割——那就是它的识别位点。例如，EcoRI这种酶在凡是看到序列GAATTC的地方就切割。由于这一精确序列只出现在基因组中某些位置，同一种酶总是把同一个分子切成同样可预测的片段。

许多识别位点是回文序列——它们在两条反向平行链上读起来相同。上链的GAATTC与下链的CTTAAG配对，而后者倒过来读又是GAATTC。正是这种对称性使一种酶能在两条链上对应的位置都进行切割。

黏性末端：奥妙所在

有些限制性内切酶在两条链上略微错开的位置切割，使每个片段都留下一小段单链突出端。这些突出端被称为黏性末端。它们之所以“黏”，是因为这个突出端乐于找到一个带有相匹配、互补突出端的伙伴，并通过碱基配对扣合在一起。

EcoRI recognition site (cut offset, leaving sticky ends):

   5'-G     A A T T C-3'
   3'-C T T A A     G-5'
        ^cut here   ^cut here

After cutting, each fragment has a single-stranded AATT overhang:

   5'-G          A A T T C-3'
   3'-C T T A A          G-5'
         (overhang)  (overhang)

Any TWO fragments cut by EcoRI now share the SAME AATT overhang,
so a human-gene fragment and a plasmid fragment can pair up:

   ...G  +  A A T T C...   ->   ...G A A T T C...
   ...C T T A A  +  G...        ...C T T A A G...

胶水：DNA连接酶

黏性末端配对只是暂时的相拥——两个片段仅靠少数几个氢键维系，会滑脱开。要让连接成为永久性的，DNA连接酶会封合骨架中的缺口，形成真正的共价键，把两个松散的片段变成一个连续、稳定的分子。

1. 用同一种限制性内切酶切割供体基因和载体，使它们拥有相同的黏性末端。
2. 把二者混合；它们互补的突出端发生碱基配对，片段对齐排列。
3. 加入DNA连接酶封合骨架，把新的重组分子彻底锁定在一起。