按电荷分选
到目前为止,我们的固定相靠油腻把分子拖住。但分子也可以带电——带正电或负电——而异性电荷相吸。于是给固定相镀上一层固定的电荷,它就会从流动中抓住带相反电荷的分子,让其余的通过。这种基于电荷的分离,就是离子交换色谱。
想象一个布满负电荷的固定相。带正电的分子黏附其上、被拖住;中性的和带负电的则流过去。要在之后把被困住的正电分子放出来,你就用一种充满竞争性正离子的流动相去冲洗柱子——一股对手的洪流,把被分析物从那些带电的位点上挤下来,重新赶回流动里。离子交换是软水滤芯的核心,也是分离氨基酸、蛋白质等带电分子的标准方法。
按大小分选:一座微孔迷宫
这里有一种把直觉颠倒过来的分离。把柱子装上多孔的小珠,珠子里钻满了细小的隧道。大分子太大,钻不进隧道,只能绕着珠子流过——一条又短又直的路——于是早早离开。小分子则钻进这座微孔迷宫深处,绕了一条又长又曲折的弯路,于是很晚才离开。这种纯粹按分子大小来分选的方法,就是尺寸排阻色谱。
由于它按大小分选,这一模式是给蛋白质、塑料等大分子“量身高”的首选——把一条巨大的链、一条中等的链和一个小碎片彼此区分开来。它也很温和,因为没有任何东西需要黏住再松开,这正适合那些娇嫩的生物分子,它们若太用力地黏附在固定相上就可能受损。
按锁与钥匙的契合分选
选择性最为精致的一种模式,能在成千上万个分子里只逮住一个。诀窍是在固定相上栓住一个特殊的搭档——一把分子的“锁”——只有目标分子(且仅有目标分子)能像钥匙一样恰好嵌进去。把一团复杂的混合物倒进去,除了那个咔哒一声扣进锁里、被牢牢留住的分子之外,其余一切都笔直地冲了过去。这种识别形状的方法,就是亲和色谱。
然后你把条件改动到刚好松开锁的握力,那一个被捕获的分子便被冲洗下来——此刻它纯净得惊人,是从人群中被精准挑出来的。亲和色谱正是实验室纯化特定抗体和许多药物的方法:一种不靠黏性、不靠大小,而靠精确的生物识别建立起来的分离。
没有流动相:在电场中赛跑
现在把流动相这个念头彻底丢开。取一块柔软的、果冻般的凝胶薄片,把带电分子放在它的一端,然后给它两端通上电场。由于异性电荷相吸,带电分子感到一股持续的牵引,朝着远端的电极在凝胶中缓缓爬行。这种靠在电场中移动来实现的分离,就是电泳——字面意思就是“被电带着走”。
决定一个分子走多快的有两件事:它带多少电荷(电荷越多,牵引越强)以及它穿过凝胶网孔有多容易(越小、越流线,越快)。凝胶本身就像前面那座按大小分选的迷宫,拖慢大分子。于是分子按电荷与大小的某种综合分选成一道道带——而对许多分子来说,电荷取决于周围的酸度,因为在一个叫作等电点的特殊酸度上,一个分子不带净电荷,便干脆停下不动了。
电泳钻进一根细如发丝的管子
平板凝胶又慢又麻烦。现代的升级版把整场赛跑缩进一根细如发丝、注满液体的玻璃管里,电场沿着它的长度施加,一个检测器在靠近远端处守望。分子在这条狭窄的通道里赛跑,经过时被计时,画出一条像色谱图一样满是峰的轨迹。这种微缩的、便于仪器化的形式,就是毛细管电泳。
这根细管有一个不动声色的好处:它散热极快。电场会使液体变热,而热会让色带变模糊;一根细如发丝的管子散热极好,于是你可以把电场开得很高,实现又快又锐利无比的分离。毛细管电泳能分辨那些电荷只有微小差异的分子,这使它成为以极高分辨率分析DNA片段和蛋白质的宠儿。