從「有沒有」到「有多少」
你在上一篇裡見到的普通 PCR，本質上是一項*有無*檢測。你跑三十來個循環，然後在凝膠上看最終那管：有一條帶，說明你的目標序列當初在場、可供複製；沒有帶，則說明它不在。這極其有用——它回答了「這個基因、這種病原體、這個突變在不在？」——但它丟掉了生物學家時刻都在問的一個問題：當初究竟*有多少*？一個含十份信使的細胞和一個含一萬份信使的細胞，跑完同一輪 PCR 可能看起來幾乎一模一樣，因為擴增會一直跑到原料耗盡，然後無論起點為何，都在大致相同的最終量上*進入平臺*。
這之所以要緊，是因為生物學裡有太多問題問的是*量*，而不僅僅是身份。一個基因在腫瘤裡相比健康組織被開到多強——它的表達水平如何？一滴血裡有多少份病毒拷貝——那個能告訴醫生治療是否奏效的病毒載量？兩項改良把 PCR 從一個開關變成了一臺測量儀器。第一項讓它能讀取 RNA 而非 DNA，於是你才有可能去問基因的活動情況。第二項即時盯著複製發生，於是你能反推出起始的量。本篇講的就是這兩件事。
RT-PCR：把 RNA 倒轉成 DNA，好讓 PCR 讀它
PCR 的 DNA 聚合酶只複製 *DNA* 模板——遞給它 RNA，則什麼也不會發生。所以要測量 RNA——而基因活動恰恰顯現於此——你需要一個轉換步驟，它不是核糖體那種「翻譯」，而是一次介質的改換：先把 RNA 抄成 DNA。做這件事的酶是逆轉錄酶，你此前已經見過它——正是逆轉錄病毒和逆轉錄轉座子用來把自己的 RNA 基因組倒寫回 DNA 的那同一種逆轉錄酶。它讀取一條 RNA 鏈，鋪下一條互補的 DNA 鏈，造出所謂的 cDNA（互補 DNA），即原始 RNA 資訊的一份忠實的 DNA 抄本。
所以 RT-PCR 只是把兩種酶串聯著跑：先由逆轉錄酶把你的 RNA 變成 cDNA，再用普通 PCR 以通常的解鏈、退火、延伸循環去擴增這份 cDNA。在你如何為逆轉錄這一步設引物上，藏著一個雖小卻好用的竅門。如果你只想要完工的、成熟的信使 RNA，可以用一小段 T 來引發——一種 oligo-dT 引物——它與成熟 mRNA 所帶的多聚 A 尾配對，於是逆轉錄只在帶尾的資訊上起步。如果你想要樣品中的每一條 RNA，則用落點遍布各處的隨機引物。這個選擇悄悄地決定了你接下來要測量的是*哪些* RNA。
得說一句名稱的事，因為它常把人絆住。「RT-PCR」指的是*逆轉錄* PCR——那個把 RNA 轉成 cDNA 的前端。「qPCR」（或「即時 PCR」）指的是*定量* PCR——也就是下一節那個即時監測的後端。它們是兩個本可各自獨立、卻時常被合在一起的想法：當你測量血液裡某種 RNA 病毒有多少時，你跑的是 RT-qPCR，二者同時進行。共用的「RT」二字確是一個貨真價實的混淆來源，所以即便實驗通常把兩者熔在一起，也請在腦中把這兩層含義分開。
qPCR：即時盯著拷貝堆疊起來
定量 PCR 的訣竅，是不再只讀*最終*那管，而是在反應仍在進行時，*每跑完一個循環就測一次*產物。為此你加入一種螢光報告分子，它的發光與在場的雙鏈 DNA 的多少成正比。最簡單的是一種染料，常用 SYBR Green，它只在嵌入雙鏈 DNA 的溝槽時才發亮；產物少時它是暗的，隨著拷貝累積，整管會越來越亮。一臺儀器在每個循環結束時讀取這亮度，於是你得到的不再是一個終點，而是一整條擴增曲線——螢光逐循環攀升。
一種與*任何*雙鏈 DNA 都結合的染料便宜卻不挑剔——它也會為錯誤的產物、或為彼此黏連的引物而發光。要得到序列特異的讀數，你可以改用一種探針：一小段與你確切目標互補、帶著螢光標記的 DNA，它只在找到並結合上匹配序列時才發亮。一種巧妙的設計是分子信標——一種摺成髮夾的探針，在它順著目標展直之前一直把自己的光關著。無論哪種方式，原理都成立：這一循環複製出的目標越多，這一循環放出的光就越多，而儀器正盯著看。
fluorescence
^
| _____________ <- plateau (reagents used up)
| ___/
| ___/ <- exponential rise (doubling each cycle)
| ___/
|- - - - - - - - -____/ - - - - - - - - - - - - <- THRESHOLD line
|________________/
| (background, target too rare to detect yet)
+----------------|----------------------------> cycle number
Cq
MORE starting target -> curve crosses threshold EARLIER -> SMALLER Cq
LESS starting target -> curve crosses threshold LATER -> LARGER Cq現在是關鍵的想法。一開始，目標太稀少，它的光升不出背景噪聲之上；最終它變得足夠豐盛，曲線便抬頭、陡峭攀升，每循環翻一倍。那個決定性的數字就是閾值循環——螢光首次越過一條設定線的那個循環，記作 Cq（有時寫 Ct）。它為何能測出起始量，原因在此：一管*起始*目標很多的樣品只需翻幾番就越線，於是它*早*越線、Cq 小。一管起始目標很少的樣品則要多翻許多番，於是它*晚*越線、Cq 大。因為每個循環都讓產物翻倍，Cq 每下降一個單位，就大致對應起始材料多了一倍——這是一把乾淨的指數尺，從「光何時出現」一路倒著讀回去。
誠實地讀 Cq：相對、絕對與數字
一個孤立的 Cq 只是個數字；把它變成一個*量*，需要一個參照。做這件事有兩條誠實的路。相對定量把你感興趣的基因，與同一樣品中測得的一個穩定表達的「管家」基因相比，再把這個比值在不同條件之間相比——回答「這個基因在腫瘤裡是否比在正常組織裡活躍一倍？」，卻始終不去聲稱一個絕對的計數。絕對定量則跑一條標準曲線：擴增一系列已知量的目標，把 Cq 映射到真實的拷貝數上，於是一個未知樣品的 Cq 就能被讀成「每毫升多少份拷貝」——一項基因表達變化或一個病毒載量，正是這樣拿到一個硬數字的。
還有第三種計數的辦法，它乾脆繞開了曲線：數字 PCR。它不是在一管裡跑一個反應，而是把樣品分散到成千上萬個微小的液滴或微孔裡——每滴裡分子如此之少，以致大多數要麼拿到零份拷貝、要麼一份。你把它們全部擴增，然後只需*數*有多少液滴發了陽性的光、有多少仍是暗的。有了足夠多的液滴，再加上一點泊松統計（一種用來核算偶爾有液滴抓到兩份分子的辦法），這個計數就是對起始分子數的一次直接、絕對的清點——不用標準曲線，不用對擴增效率做任何假設。數字 PCR 用誠實的算術換下了 Cq 那把模擬尺，這使它在你需要從巨大背景中檢出一個極其稀有的變體時成為首選——比如血液裡漂著的寥寥幾段腫瘤 DNA 碎片。
這為何把生物學變成一門測量的科學
退後一步，看看這些改良買到了什麼。普通 PCR 給了生物學一臺*探測器*；RT-PCR 與 qPCR 給了它一臺*儀表*。一下子，你能從一撮樣品、在一個下午裡提出定量的問題、得到定量的答案：一個細胞受壓時這個基因升高多少倍；一位患者的病毒載量在用藥後如何逐日下降；這條微弱的帶是真信號還是汙染。世界之所以能以工業規模檢測一種呼吸道病毒，靠的正是 RT-qPCR——把病毒 RNA 逆轉錄，再憑閾值循環把它數出來，每天數百萬次。
把它的侷限和它的威力同樣看清。qPCR 測量的是一個或少數幾個你*已經知道*要找的目標——你必須針對一段你叫得出名字的序列去設計引物，所以它無法發現意料之外的東西。要一次性普查一個細胞裡的*全部* RNA、且不帶一份預先的名單，你需要這一級裡接下來的那些定序方法，它們以成千上萬計地讀取資訊，而不是去數其中某一個。而處在 RT-PCR 核心的那一步 cDNA，與一座cDNA 文庫、與 RNA-seq 背後的第一招是同一個：把脆弱的 RNA 抄成穩定的 DNA，好讓工具箱裡其餘的傢伙能讀它。qPCR 是精確、靶向的*測量*；而接下來的幾篇，講的是你如何在基因組的尺度上*讀出那些字母本身*。