為什麼一個切下來的基因需要搭車
上一篇指南裡你看著一種限制酶做了一件近乎神奇的事：沿雙螺旋掃描，找到一小段回文，在恰好相同的位置把兩條鏈都剪開，留下一段帶整齊懸突末端的碎片。假設那段碎片正是你關心的基因——比方說，人的胰島素基因。你現在把它握在管子裡，作為一小段自由漂浮的 DNA。你能拿它做什麼？單憑它本身，幾乎什麼都做不了。它的量太少，少得無法研究，你讀不出單個分子，而你一把它放進活細胞，細胞的清理酶就會把它嚼成碎片。一個裸露的基因，是一段無從保存、複製或讀取的資訊。
解決之道，是別再把基因當成要直接研究的貨物，而是把它黏進一段細胞本就懂得保存和複製的 DNA 裡。那個載具就是選殖載體——一個被改造成運輸工具的、小巧而溫順的 DNA 分子。你把碎片貼進載體，做成一個合二為一的重組DNA分子，把整個東西塞進一個細菌，剩下的交給細菌去做。隨著細胞生長分裂，它一遍又一遍地複製載體——連同你的搭車基因一起。一夜之間，你從一個細胞長出億萬個一模一樣的細胞，每一個都帶著你那基因的完美拷貝。這一句話就道出了選殖的含義：不是造一隻羊，而是造出一群都握著同一段選定 DNA 的細胞。
質粒和它三個不可或缺的部件
最得力的載體是質粒：一個小小的雙鏈 DNA 環，通常幾千個鹼基對上下，住在細菌體內、與主染色體完全分開。質粒不是人類的發明——細菌天生就攜帶它們，常在上頭四處傳遞抗生素抗性基因。分子生物學家不過借用了這個點子，把環重新搭建一番，剪掉不想要的、添上想要的。一個現代的選殖質粒，是一個被改造過的小環，而幾乎每一個都帶著同樣的三個工作部件。學會這三個，你就掌握了整套工具箱的核心。
第一，複製起點，常寫作 *ori*。這是一小段序列，細胞的複製機器把它認作開始複製的地方——正是你在學習染色體如何被複製時見過的那種起點。沒有它，質粒就只會呆坐在那兒無所作為，並隨細胞分裂被稀釋掉。有了它，質粒每一代都由宿主自己的酶來複製，於是它得以留存並增殖。複製起點還悄悄定下了拷貝數：有些起點讓每個細胞只保留一兩份質粒，另一些則放任它漲到幾百份——當目標是盡可能多地收穫 DNA 時，你要的正是後者。
第二，選擇標記——它回應的是一個殘酷的實際難題。當你把質粒和細菌混在一起，真正接收到質粒的細胞只佔極小一部分；其餘的什麼也沒拿到。你若只是把混合物鋪到培養皿上，接收了你質粒的細胞，會被沒接收的細胞淹沒得毫無希望，你永遠也挑不出來。經典的選擇標記，是嵌進質粒裡的一個抗生素抗性基因。你把細胞養在摻了那種抗生素的平板上，邏輯就變得致命地簡單：任何沒有質粒的細胞都沒有抗性、會死掉，而每一個活下來的，必定帶著你的質粒。毒藥替你做了分揀。平板上一片菌落，就是一片你確知正握著你基因的細胞。
第三，多選殖位點，又稱多聚接頭。這是你基因進場的裝貨口。它是一小段精心設計的 DNA，密集排布著許多種不同限制酶的辨識位點，每一種在整個質粒裡都*只出現一次*。這種唯一性正是關鍵所在。用其中一種酶切質粒，它就只在一處打開——那個選殖位點——環的其餘部分紋絲不動，留下的懸突末端恰與你插入片段的末端相配。你的碎片與開了口的質粒，如今有了互補的黏性末端，於是它們靠鹼基配對啪地接上，再由一種 DNA 連接酶把接口封成一個連續的環。質粒，實際上就是一個現成的插槽，等著任何你能切來合身的基因。
載體如何把一段碎片變成可以養起來的東西
看這三個部件在一次操作裡如何協同。結果便是重組 DNA 的核心把戲：一段單憑自己毫無用處的碎片，變成了一窩活著、長著、可收穫的、彼此相同的菌落。請注意，這裡沒有任何一步需要古怪的化學——限制酶來切，連接酶來接，細菌負責複製和生長。你做的大多只是挑對零件，然後讓生物學自己運轉。
- 都切開。用一種限制酶在選殖位點處剖開質粒，並用同一種酶把你的基因從源 DNA 裡切出來，於是兩塊都帶上相配的黏性末端。
- 把它們接起來。把開口的質粒和你的碎片混在一起；互補的懸突彼此配對，DNA 連接酶封住骨架，造出一個帶著你基因的重組環。
- 把它送進細胞。在能讓細胞短暫吸入 DNA 的條件下，把這些環與細菌混合——這種吸收稱為轉化。只有少數細胞會成功。
- 做選擇。把細胞鋪到含有抗生素的平板上。只有攜帶質粒（及其抗性標記）的細胞能存活，於是每一個長出的菌落都握著你的基因。
- 擴大培養並收穫。挑一個菌落，過夜養成億萬個細胞，每個細胞在分裂時都複製質粒。把細胞脹破，你便回收到大量純淨的你的基因。
更大的貨物需要更大的運輸工具
質粒很美妙，但有裝載上限。插入片段一旦超過大約一萬五千個鹼基對，質粒就變得不穩定——它複製得很差，細胞也傾向於把它吐出來。裝一個基因這沒問題，可一個連帶全部內含子的人類基因、或是你想研究的一整段染色體區域，都可能大得塞不進去。於是人們造出了一族大容量載體，每一種都拿一些便利去換攜帶更大乘客的能力。它們共通的訣竅是一樣的：借用一套本就在四處搬運大段 DNA 的天然系統，再把它重塑成一輛運輸工具。
往上的第一步借用了一種病毒。噬菌體是感染細菌的病毒，研究得很透的 λ 噬菌體自帶一個蛋白質外殼，能高效地把它的 DNA 注射進細胞。把噬菌體自己的中段挖掉，你就能塞進約兩萬個鹼基對的外源 DNA，再讓噬菌體去打包並投遞——這比哄著細菌去吞下裸質粒高效得多。把這個點子再往前推，你就得到柯斯質粒，一種巧妙的雜交體：它保留了噬菌體的打包訊號，但一旦進入細胞，其餘表現就像個質粒，能攜帶多達約四萬五千個鹼基對。這架階梯每上一級，都為貨物買來更多空間。
對於基因組計畫所需要的那種真正龐大的插入片段，有兩個巨人頂起了上限。BAC——細菌人工染色體——是用一種天然細菌質粒造的，它每個細胞只複製一兩份，正好讓哪怕巨大的插入片段也保持穩定；一個 BAC 通常攜帶幾十萬個鹼基對，BAC 正是人類基因組計畫的中堅。更大的是 YAC——酵母人工染色體——它根本不在細菌裡養，而是在酵母裡，由一條真染色體最起碼的幾樣必需件拼成：一個複製起點、一個著絲粒（好讓它在細胞分裂時被正確地拉過去），以及給兩端封口的端粒。一個 YAC 能裝下一百萬個鹼基對甚至更多，儘管它更難伺候、也更容易把插入片段重排掉。有一條粗略的規律：貨物越大，你為攜帶它而在便利和穩定上讓出的就越多。
VECTOR TYPICAL INSERT SIZE GROWN IN ------------------------------------------------------------- plasmid up to ~15 kb bacteria bacteriophage (lambda) ~9-23 kb bacteria (phage) cosmid ~30-45 kb bacteria BAC ~100-300 kb bacteria YAC ~100 kb - >1,000 kb yeast ( kb = kilobases = thousand base pairs ) bigger cargo -> bigger, fiddlier vehicle
從複製一個基因到造出它的蛋白質
到目前為止講的全是*複製*一個基因——保存它、增殖它、收穫純淨的 DNA。但你常常想要更多：基因所編碼的那個實實在在的蛋白質，而且要大量地造出來。一個樸素的選殖載體單憑自己做不到這一點。回想這架階梯早先講過的中心法則——DNA -> RNA -> 蛋白質。一個基因只有當細胞把它轉錄、再翻譯時，才會變成蛋白質，而這需要基因周圍有恰當的訊號。細菌不會自動去讀你只是停泊在它細胞裡的一個人類基因；人類基因自己的那些開關，對細菌的機器來說毫無意義。
答案是表達載體——一種帶有額外部件的選殖載體，這些部件把造蛋白質的明確指令交到宿主細胞手上。緊挨選殖位點上游，坐著一個宿主 RNA 聚合酶能辨識的強啟動子，再加上核糖體起始翻譯所需的訊號，於是你的基因一放進去，細胞就開足馬力地把它轉錄並翻譯。最好的表達載體還把啟動子置於一個你能掌控的開關之下——通常是你往培養物裡加入的一種小分子——好讓細胞先平和地長起來，然後才被告知傾盡精力去大量生產你的蛋白質（這種蛋白質量大時本可能有毒）。這就是重組蛋白表達，如今幾乎所有治療用的胰島素都是這麼造出來的：把人胰島素基因放進一個表達載體，養在一缸缸分泌人類蛋白質的細菌或酵母裡。
兩條誠實的提醒，讓這事不至於聽上去像魔法。第一，細菌讀一個基因的方式與人類細胞略有不同——它不能把內含子剪掉，也會略過人類蛋白質折疊與運作所需的許多化學修飾，所以對某些蛋白質，你必須改用酵母、昆蟲或哺乳動物細胞作宿主，配上為它們打造的載體。（這也是為什麼生物學家常選殖一個基因去掉內含子的 cDNA 版本，而非原始的基因組拷貝——不過那是後面幾篇指南的故事。）第二，被高速逼出來的外源蛋白質，可能凝成無用的不溶團塊，所以哄出一份摺疊良好、有活性的好產量，本身就是一門手藝。表達載體給了你造蛋白質的機器；從中拿到*能用的*蛋白質，才是真正功夫大多仍棲身之處。