同時看兩個基因：自由組合與 9:3:3:1

從一個基因到兩個基因

雙基因雜交同時追蹤兩個基因。孟德爾用了種子形狀（圓 R 對皺 r 顯性）和種子顏色（黃 Y 對綠 y 顯性）。他把純種圓黃植株（RRYY）與純種皺綠植株（rryy）雜交。和之前一樣，每株 F1 從父母雙方各得每個基因的一個等位基因，所以全部 F1 都是 RrYy——又圓又黃，因為兩個顯性都顯現。

有意思的問題是：當這些 RrYy 植株自花授粉時會發生什麼？圓會不會始終跟著黃一起遺傳，就像它們在最初親本中那樣配對？還是這些基因會自由洗牌？答案就是孟德爾第二定律。

自由組合定律

自由組合定律說的是：不同基因的等位基因，會彼此獨立地分配進配子。一個配子拿到 R 還是 r，與它拿到 Y 還是 y 毫無關係。因此一株 RrYy 植物會產生四種數量相等的配子：RY、Ry、rY 和 ry——各佔四分之一。

4×4 方格與 9:3:3:1

由於每個親本有四種配子，龐納特方格變成了帶十六個格子的 4×4 網格。把這十六個按表型歸類，就得到F2 世代經典的表型比例。

Cross: RrYy x RrYy
Gametes from each parent: RY, Ry, rY, ry

        RY      Ry      rY      ry
      +-------+-------+-------+-------+
  RY  | RRYY  | RRYy  | RrYY  | RrYy  |
      +-------+-------+-------+-------+
  Ry  | RRYy  | RRyy  | RrYy  | Rryy  |
      +-------+-------+-------+-------+
  rY  | RrYY  | RrYy  | rrYY  | rrYy  |
      +-------+-------+-------+-------+
  ry  | RrYy  | Rryy  | rrYy  | rryy  |
      +-------+-------+-------+-------+

Count by phenotype (R_ = round, Y_ = yellow):
   9  round  yellow   (R_Y_)
   3  round  green    (R_yy)
   3  wrinkled yellow (rrY_)
   1  wrinkled green  (rryy)
                    ->  9 : 3 : 3 : 1

雙基因 F2 方格：十六個等可能的格子，歸併為 9:3:3:1 的表型比例。

注意中間那兩類——圓綠與皺黃。這些是任一最初親本都不曾有的新組合。它們正是自由組合的可見證據：若圓始終與黃鎖在一起，這些重組類型就絕不可能出現。孟德爾真實的 F2 計數（315 : 101 : 108 : 32）接近 9:3:3:1，而新性狀組合的出現，恰恰是這次雜交如此重要的原因。