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PCR與凝膠電泳

兩個日常主力工具:PCR在試管中把選定的一段DNA複製數百萬次,而凝膠電泳按大小分離DNA片段,讓你看清自己手上有什麼。

PCR:DNA的影印機

在細菌中選殖很強大,但速度慢。聚合酶連鎖反應(PCR)試管中複製一段特定的DNA,完全不需要細胞,幾個小時就能完成。它借用細胞自身的複製酶——DNA聚合酶,並一遍又一遍地重複同樣的三步循環。

是什麼讓PCR只複製你想要的那一段?是叫做引子的短小定製DNA片段。你設計兩條引子,使它們與目標兩側的序列鹼基配對——每條鏈上各一條。聚合酶只從引子開始複製,因此它精確地填補兩條引子之間的區域,而不複製別的部分。

  1. 變性:加熱到約95 °C,使雙螺旋解開為兩條單鏈。
  2. 退火:冷卻到約55 °C,使引子與其匹配位點鹼基配對。
  3. 延伸:升溫到約72 °C,使DNA聚合酶從引子開始合成新鏈。
  4. 重複循環25–35次;每一輪目標加倍,因此拷貝呈指數增長。

凝膠電泳:按大小分離

一旦你有了DNA片段,就需要看到它們並核對其大小。凝膠電泳能做到這一點。你把DNA加進一塊果凍狀凝膠一端的樣品孔裡,並施加電場。DNA帶負電,因此向正極遷移——但它必須從凝膠的網孔中穿行而過。

較小的片段輕鬆穿過網孔,跑得遠;較大的片段被拖慢,停留在樣品孔附近。過一會兒,混合物就鋪展成一條條獨立的條帶,按大小排列。把你的條帶與已知大小的「梯」相比較,就能知道每個片段有多大——這是快速核對PCR或限制酶切割是否給出了你預期片段的方法。

Gel after the run (DNA moves DOWN, toward + electrode):

   wells:  [Ladder] [Sample]      <- start, near - electrode
           =====    =====
   large   --3000--                slow, stays high
           --2000-- ----2000----   sample band lines up at 2000
   small   --1000--                fast, travels far
                    ---- (none) ----
           v v v v  v v v v
                                    <- finish, near + electrode

Reading: the sample's single band sits level with the 1000-bp
rung of the ladder, so the PCR product is about 1000 base pairs.
較小的DNA跑得更遠;把條帶與梯對齊即可讀出其鹼基對大小。