會讀序列的剪刀
要把一個基因貼到某處，你首先得把它乾淨地剪下來。限制酶是一種蛋白質，最初借自細菌，它掃描DNA，並只在找到特定短序列處才切割——那就是它的辨識位點。例如，EcoRI這種酶在凡是看到序列GAATTC的地方就切割。由於這一精確序列只出現在基因組中某些位置，同一種酶總是把同一個分子切成同樣可預測的片段。
許多辨識位點是迴文序列——它們在兩條反向平行鏈上讀起來相同。上鏈的GAATTC與下鏈的CTTAAG配對，而後者倒過來讀又是GAATTC。正是這種對稱性使一種酶能在兩條鏈上對應的位置都進行切割。
黏性末端：奧妙所在
有些限制酶在兩條鏈上略微錯開的位置切割，使每個片段都留下一小段單鏈突出端。這些突出端被稱為黏性末端。它們之所以「黏」，是因為這個突出端樂於找到一個帶有相匹配、互補突出端的夥伴，並透過鹼基配對扣合在一起。
EcoRI recognition site (cut offset, leaving sticky ends):
5'-G A A T T C-3'
3'-C T T A A G-5'
^cut here ^cut here
After cutting, each fragment has a single-stranded AATT overhang:
5'-G A A T T C-3'
3'-C T T A A G-5'
(overhang) (overhang)
Any TWO fragments cut by EcoRI now share the SAME AATT overhang,
so a human-gene fragment and a plasmid fragment can pair up:
...G + A A T T C... -> ...G A A T T C...
...C T T A A + G... ...C T T A A G...膠水：DNA連接酶
黏性末端配對只是暫時的相擁——兩個片段僅靠少數幾個氫鍵維繫，會滑脫開。要讓連接成為永久性的，DNA連接酶會封合骨架中的缺口，形成真正的共價鍵，把兩個鬆散的片段變成一個連續、穩定的分子。
- 用同一種限制酶切割供體基因和載體，使它們擁有相同的黏性末端。
- 把二者混合；它們互補的突出端發生鹼基配對，片段對齊排列。
- 加入DNA連接酶封合骨架，把新的重組分子徹底鎖定在一起。